О нас
Амбулатория
Лаборатория
Галерея
Контакты
 

Задать вопрос доктору

Образовательные программы

Инсульт

Вегетативное состояние

Стволовые клетки

Черепно-мозговая травма

Выездные консультации и лечение

Лечение лазером грыжи межпозвонковых дисков

Лечение и реабилитация в России и за рубежом

Лечение и уход за пролежнями

Наркоз ксеноном

Гипотермия

Госпитализация

Подготовка к авиаперелету, поездке в отпуск

Ссылки

Сотрудники отделения

ENGLISH VERSION

O'zbek tilida versiya

Version Тоҷикистон

版本:中文

Ассоциация специалистов по лечению заболеваний центральной нервной системы

 

 

Тематический обзор


Применение стволовых клеток для улучшения восстановления после инсульта:
обзор


Tim England1, Paul Martin2, и Philip M.W.Bath1*
Оригинальная версия статьи на английском языке:
England Т., Martin P., Bath P.M.W. Stem cells for enhancing recovery after stroke: a review. International Journal of Stroke 2009, Vol 4, Issue 2, pp. 101-110
 

Возможные применения стволовых клеток чрезвычайно многообразны, и разработка их применения при ишеми­ческом инсульте все еще находится в периоде младенчес­тва. Вопрос о доступе к стволовым клеткам для исследова­ний остается спорным, однако стволовые клетки могут быть получены как от животных, так и от человека. Несмотря на ограниченность понимания механизмов их действия, клинические исследования, оценивающие при­менение стволовых клеток при инсульте у человека, уже проводились. Выполняются также исследования, оценива­ющие применение гемопоэтических прекурсоров, моби­лизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, подхода, который предоставит аутологичные средства для применения стволовых клеток в лечебных целях. В данном обзоре резюмированы современные знания о стволовых клетках и их возможностях для содействия восстановлению после инсульта.

Ключевые слова: гранулоцитарный колониестимулирую- щий фактор, ишемический инсульт, стволовые клетки.

Введение

Инсульт - третья ведущая причина смерти в мире; он приводит к разрушительным последствиям как для боль­ных, так и для ухаживающих за ними лиц. Более полови­ны выживших после инсульта больных оказываются зависимыми от окружающих в повседневной активности [1]. Ежегодно в Соединенном Королевстве возникают 110 тыс. первичных и 30 тыс. повторных инсультов; 10 тыс. случаев инсульта возникают у лиц моложе 65 лет; 60 тыс. людей умирают от инсульта. Более 5% ресурсов Нацио­нальной системы здравоохранения Соединенного Королевства (NHS) и социальных служб расходуются на боль­ных с инсультом [2]. Поиски эффективного вмешательст­ва для преодоления этого бремени, которое присутствует во всем мире, оказались трудной задачей: ацетилсалици­ловая кислота может быть широко применена, но лишь умеренно эффективна, тогда как альтеплазе высоко эффективна, но не может быть широко применена; лече­ние антикоагулянтами оказалось неэффективным [3], а разнообразные подходы нейропротекции продолжают исследоваться [4]. Фактически, за исключением ацетил­салициловой кислоты, тромболитической терапии и гемикраниэктомии, в остальном клиническое ведение ос­новывается на уходе и оказании поддерживающей помо­щи в специализированном инсультном отделении [5-7].

Одна возможно важная область для исследований лече­ния инсульта - применение стволовых клеток для улуч­шения восстановления. Определения понятия "стволовая клетка" эволюционируют по мере появления новых зна­ний по данной тематике. В настоящее время стволовой считают клетку, обладающую двумя отличительными свойствами: способностью к самообновлению и способ­ностью дифференцироваться в клетки многих типов (по- тентность) [8]. Клетка-прогенитор также обладает этими характеристиками, но имеет более ограниченные возмож­ности, а именно может дифференцироваться в клетки лишь ограниченного числа типов и имеет ограниченную способность к самообновлению [8]. В настоящее время проводятся исследования применения стволовых клеток при таких состояниях как диабет, рак, нейродегенератив- ные заболевания (например, болезнь Паркинсона), забо­левания сердца [9-12]. В данном обзоре рассматривается современное положение дел с применением стволовых клеток при ишемическом инсульте, с уделением особого внимания гемопоэтическим стволовым клеткам (ГСК).


 

Источники стволовых клеток для лечения при инсульте

Вопреки широко распространенному представлению о том, что "головной мозг не регенерирует", сейчас полу­чила широкое признание возможность спонтанного  постнатального (во взрослом возрасте) нейрогенеза [13]. Для трансплантации стволовых клеток доступны несколько источников клеток, которые могут быть подразделены на основании нескольких характеристик: экзогенный или эндогенный источник клеток; клетки по­лучены из эмбрионального, фетального или взрослого ор­ганизма; нервная или ненервная природа клеток; плюри- потентность (способность к неограниченному делению) или мультипотентность (в обычных условиях регенера­ция только в клетки "собственной ткани", но наличие спо­собности трансдифференциации в клетки других тканей). 

 

 

Нервная клетка прогенитор (НКП)

В головном мозге как человека, так и животных имеются многочисленные участки продолжающегося образования нейронов и клеток глии. У человека нервные стволовые клетки находятся в перивентрикулярных участках и коре мозга на протяжении развития, и было показано, что они сохраняются и во взрослом возрасте в ряде участков, в частности - зубчатой извилине гиппокампа, черной суб­станции, обонятельной луковице [13-17]. В исследованиях с применением животных моделей было показано, что ишемический инсульт сопровождается дифференциацией клеток в нейроны, фенотипически сходные с теми, кото­рые были утрачены в зоне ишемического повреждения [18], и это свидетельствует о способности мозга взрослых особей к самозаживлению. Как было отмечено у грызунов, клетки из субвентрикулярной зоны и гиппокампа голов­ного мозга взрослого человека могут развиваться in vitro, дифференцироваться во всех трех направлениях (нейро- нальном, астроцитарном, олигодендроглиальном) [19], и, будучи введенными внутривенно при моделировании инсульта у крыс могут улучшить функциональное восста­новление [20]. При введении фетальных нервных стволо­вых клеток человека крысам с инсультом были получены противоречивые результаты [21]; хотя клетки мигрирова­ли через поврежденный стриатум, в ядре трансплантата оставались недифференцированные клетки и незрелые клетки нервного направления развития. Пересаженные клетки не дифференцировались в астроциты и олигоден- дроциты. Однако до настоящего времени нет набора мар­керов, которые позволяли бы точно идентифицировать нервную стволовую клетку и отличить ее от других более ограниченных прогениторов, прекурсоров или дифферен­цированных клеток. Продолжаются исследования по выделению истинных нервных стволовых клеток и зон, в которых они существуют. Например, культивированные клетки из областей вне стриарной субвентрикулярной зоны в постнатальном мозге имеют более ограниченные способности к самообновлению, чем детально охарак­теризованные нервные стволовые клетки из субэпенди- мальной зоны желудочков [22]. Для формального отож­дествления клеток как нервных стволовых клеток все еще необходимо функциональное проявление мультипотен- тности, самообновления и долговечности.

Эмбриональные и фетальные1 стволовые клетки

У страдающих болезнью Паркинсона лиц отмечалось бла­гоприятное действие после трансплантации фетальных стволовых клеток человека [11], однако возможности поставки этих клеток ограничены, а их применение сопря­жено с трудностями этического характера, присущими до­быче человеческой фетальной ткани в целях получения стволовых клеток. Эмбриональные стволовые клетки спо­собны вырабатывать большие количества нервных клеток прогениторов и, в принципе, плюрипотентны с неограни­ченной способностью к размножению и росту; было обна­ружено, что мышиные эмбриональные стволовые клетки, будучи пересаженными крысам с инсультом, способны дифференцироваться в нейроны и глиальные клетки [23, 24] и выживают на протяжении до 12 недель. Возможное препятствие заключается в том, что они склонны разви­ваться в разнородную смесь нервных прекурсоров и диф­ференцированных нейронов или глиальных и остаточных стволовых клеток и небольшого числа ненервных клеток [25]; здесь трудность заключается в том, чтобы направить дифференциацию к образованию гомогенной популяции клеток. Другой недостаток заключается в их способности к злокачественной трансформации. Например, когда недифференцированные мышиные эмбриональные ство­ловые клетки были ксенотрансплантированы крысам, у которых был моделирован инсульт, была отмечена нейрональная дифференциация; но когда те же клетки были трансплантированы в гомологичный мышиный мозг, клетки не мигрировали и образовали высокозлокачест­венную тератокарциному [26].

Свиные фетальные клетки

Больным с болезнью Паркинсона и болезнью Хантингтона выполнялась трансплантация нейронов плода свиньи [27, 28], и этот донорский источник расценен как относительно безопасный. Однако введение инородных клеток сопряже­но с риском отторжения и необходимостью в хроническом подавлении иммунитета. Более того, ксенотрансплантация может привести к передаче свиных вирусов, таких как свиной эндогенный ретровирус, хотя одно исследование не выявило существования такой проблемы [29].

Иммортализированные2 клеточные линии

Клетки, полученные либо путем генетической трансфор­мации, либо культивированием эмбриональной и взрос­лой ткани, представляют готовый и неограниченный источник клеток, и таким образом сглаживают острые этические вопросы в отношении получения абортной фетальной ткани. Например, клетки LBS-Neurones (Layton Bioscience Inc., Sunnyvale, CA, USA) были получены из ли­нии человеческих клеток прекурсоров NT2/D1, с индукци­ей дифференциации в нейроны добавлением ретиноевой кислоты. Эта клеточная линия была изначально получена из опухоли яичка человека более 20 лет назад [30], а окон­чательный продукт представлял собой популяцию нерв­ных клеток, практически неотличимых от терминально дифференцированных постмитотических нейронов [31]. Основное опасение в связи с применением такого подхода связано с возможностью злокачественного перерождения после лечебной трансплантации клеток такого типа.

Стволовые клетки, полученные из крови и костного мозга

Стромальные клетки костного мозга, стволовые клетки пуповинной крови и стволовые клетки периферической крови (СКПК) являются альтернативными источниками стволовых клеток, и их применение не сопряжено с существенными этическими трудностями, если их транс­плантация выполняется в аутологичном порядке. Кост­ный мозг и пуповинная кровь состоят из клеток многих видов, включая гемопоэтические и эндотелиальные пре­курсоры (клетки CD34') и негемопоэтические клетки (мезенхимальные стромальные или CD34" клетки). При­близительно 10-20% костномозговых стволовых клеток (КМСК) мультипотентны, а остальные - представляют более дифференцированные коммитированные (с пре­допределенным путем дифференцирования) клетки [32]. Остается спорным, могут ли эти последние клетки тран- сдифференцироваться в нервные клетки; клетки из кост­ного мозга могут принимать характеристики нервных клеток [33-35], но клетки атипичны (сферические по природе, с малочисленными отростками) [36], и дискути­руется возможность того, что трансплантированные клетки спонтанно сливаются с клетками реципиента и принимают их фенотип [37]. Вдобавок к этому, было показано, что у мышиных ГСК с возрастом снижается способность к самообновлению, усиливается апоптоз, и в условиях стресса нарастает функциональное истощение [38]. Тем не менее, введение КМСК улучшало исходы в экспериментальных моделях инсульта [39, 40]. Было от­мечено также сохранение познавательных функций при внутривенной трансплантации мезэнхимальных стволо­вых клеток (МСК) крысам при моделировании окклюзии средней мозговой артерии [41]. Аналогичным образом, было отмечено улучшение поведенческих и неврологи­ческих функций при внутривенном введении клеток CD133+ крысам с инсультом [42]; маркер стволовых клеток CD 133 - трансмембранный поверхностный клеточный антиген - специфично экспрессируется на 30-75% клеток CD34' и может быть полезен при транс­плантации стволовых клеток, поскольку они менее дифференцированы. Однако в этом конкретном иссле­довании [42] улучшение поведения обнаруживалось только при применении внутривенной трансплантации не позже чем через 1 час после инсульта, а уменьшение размера мозгового инфаркта отмечалось только после внутримозговой трансплантации клеток.

Гемопоэтические стволовые клетки (клетки CD34)

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - стволовые клетки взрослого (происхождение которых недостаточно изучено), которые дают начало клеткам крови всех ти­пов, включая миелоидные и лимфоидные. Молекула CD34 - поверхностный клеточный гликопротеин, экс- прессируемый на ГСК и используемый для облегчения их идентификации, хотя возможно существование и ГСК CD34" [43]. Ишемический инсульт приводит к мобилиза­ции клеток CD34* (что отмечается также и при инфаркте миокарда [44]), всплески которой отмечаются на протя­жении первых 10 дней после инсульта [45, 46]; более высокие уровни мобилизации клеток CD34+ сопровожда­ются лучшими неврологическими исходами [45]. Источ­ник и судьба этих клеток неизвестны. Интересно, что число циркулирующих клеток CD34+ обратно связано с риском последующего рецидива инфаркта головного мозга [47] и сердечно-сосудистых событий [48]. Прини­мая во внимание эти изменения, есть основания полагать что содействие мобилизации клеток CD34* может оказы­вать благоприятное лечебное действие. В одном недавнем исследовании мононуклеарные клетки были выделены из периферической крови 30 больных с ост­рым инсультом и культивировались ex vivo [49]. Эти выращенные вне организма клетки представляли раз­нородную популяцию клеток с эндотелиальной и нейро- нальной морфологией; выращенные вне организма нейрональные клетки, будучи трансплантированными в головной мозг крысы через 4 дня после ишемии, выжи­вали (на протяжении более 6 мес.), дифференцировались в нейрональные фенотипы, и способствовали улучше­нию функционального восстановления.

Мобилизация стволовых клеток

Выработка стволовых клеток, производных из костного мозга, стимулируется гормонами, называемыми колони- естимулирующими факторами (КСФ). Стволовокле- точный фактор (СКФ) управляет дифференциацией стволовых клеток CD34+; гранулоцитарный колониести- мулирующий фактор (Г-КСФ) - нейтрофилов; эритропо- этин - эритроцитов; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - макрофа­гов и нейтрофилов; макрофагальный колониестимули­рующий фактор (М-КСФ и КСФ-1) - моноцитов; тром- бопоэтин - тромбоцитов. СКФ, Г-КСФ, эритропоэтин, ГМ-КСФ, М-КСФ были изучены в доклинических моде­лях ишемического инсульта [50-54]. В настоящее время выполняются клинические исследования применения Г-КСФ и эритропоэтина при инсульте у человека.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

Преднамеренное привлечение гемопоэтических стволо­вых клеток CD34* из костного мозга в периферическую кровь под действием Г-КСФ - клинический процесс, названный мобилизацией СКПК. Хотя механизм этого процесса в значительной мере неизвестен, Г-КСФ в отдельности или в сочетании с химиотерапией рутинно применяется в клинической практике для сокращения продолжительности нейтропении у больных с гематоло­гическими заболеваниями, или для мобилизации и извле­чения СКПК с целью последующей аутологичной или ал- логенной инфузии. Его применение при инсульте - ново, и в настоящее время исследуется как у животных, так и у человека. В лечебных целях могут быть получены аутоло- гичные стволовые клетки костного мозга, однако такой подход малопривлекателен, принимая во внимание необ­ходимость в многократных костномозговых пункциях.

В моделях ишемического инсульта у крыс и мышей несколькими исследовательскими группами было пока­зано, что Г-КСФ оказывает нейрозащитное действие в различных дозах [55], при выполнении тромболизиса [56, 57]; улучшает функциональное восстановление [52, 58], способствует ангиогенезу [58-60] и нейрогенезу [58, 60, 61]. Всеми группами было показано, что Г-КСФ уменьшает объем повреждения при инсульте. Однако Г-КСФ может приводить к нарушению поведенческих функций [62], и может не оказывать благоприятного действия, будучи введенным в хронической фазе инсуль­та [63] или в моделях глобальной ишемии [64].

Действие Г-КСФ, вероятно, осуществляется посредс­твом нескольких механизмов. Ангиогенез и нейрогенез могут быть активированы посредством мобилизации клеток CD34+, но дальнейшее изучение эффектов Г-КСФ выявило, что нейроны и нервные стволовые клетки взрослых экспрессируют рецепторы Г-КСФ, и эта экспрессия индуцируется ишемией [61]. Доклини­ческие исследования показали, что Г-КСФ может играть противовоспалительную роль, поскольку вызы­вает угнетение индуцируемой синтетазы оксида азота (iNOS) [65] и других воспалительных медиаторов, таких как интерлейкин-1 [66]. Полагают, что нейрозащитное действие Г-КСФ осуществляется за счет анти-апоптоти- ческой активности посредством перенастройки на бо­лее высокий уровень активности Stat 3 (signal transducer and activator of transcription 3 - преобразователь сигна­ла и активатор тракнскрипции) и сигнального пути JAK/STAT [65].

 

Механизмы восстановления после инсульта

Нарушения двигательных, чувствительных и позна­вательных функций являются частым результатом инсульта и обусловливают выраженные нарушения функциональной состоятельности и социальную стес­ненность. Восстановление движений и двигательных функций представляет фокус реабилитации, основанной на физической терапии. Восстановление двигательных и познавательных функций достигается в разной мере посредством ряда механизмов [67-71]:

    Демаскирование (проявление) - вовлечение существу­ющих, но латентных связей;

    Спраутинг (ветвление, формирование отростков) - форми­рование новых нервных связей (включая синаптогенез);

    Долгосрочное потенцирование - активация памяти и обучения;

    Разрешение диасхиза (отдаленного функционального угнетения);

    Нейрогенез - замещение утраченных нейронов.

В дополнение к этому, при моделировании у животных восстановления функций после инсульта было обнару­жено, что повторная практика или упражнения могут вызвать эндогенный нейрогенез и экспрессию сигналь­ных молекул (которые, возможно, лучше называть "регенокины"), таких как мозговой нейротрофический фактор (МНТФ), который затем стимулирует нейрональ- ную починку, улучшая обучение и память [72].

Растет интерес к применению вмешательств, которые могут усиливать нормальные восстановительные явле­ния после инсульта - либо фармакологически (такими лекарственными средствами, как амфетамин ("реабили­тационная фармакология") [73]), либо с недавних пор - применением стволовых клеток. Успехи в молекулярной биологии создают возможности для применения клеточ­ной терапии с целью усиления регенерации нейронов в дополнение к программе нейрореабилитации. Однако механизмы, посредством которых стволовые клетки могут улучшать восстановление, все еще недостаточно понятны. Существуют две теории:

    Нейропротекция (нейрозащита) - предотвращение гибели подвергшихся повреждающему воздействию нейронов в острой фазе ишемии головного мозга;

    Нейрорепарация (нейрозаживление) - "починка" поврежденных нейрональных сетей в хронической фазе ишемии головного мозга.

При рассмотрении того, как стволовые клетки содейст­вуют восстановлению, можно полагать, что эти два меха­низма в определенной мере перекрывают друг друга.

Уменьшение апоптоза и воспаления

Вмешательство, уменьшающее размер повреждения при инсульте, обычно - уменьшением гибели нейронов в области ишемической полутени, свидетельствует о ней- розащитной активности. Реализация этого механизма была показана при введении ГСК и внутримозговой трансплантации человеческой нервной стволовой клетки в моделях ишемического инсульта [74, 75]. Однако уменьшение размера повреждения не всегда отмечается при трансплантации стволовых клеток, полученных из разных источников [39, 76-78], что может быть обуслов­лено различиями в методах и моментах времени выпол­нения трансплантации после инсульта.

Нейропротекция может быть также опосредована ослаблением воспалительного ответа. Вероятно, что ство­ловые клетки играют центральную роль в управлении воспалительным каскадом, посредством выработки ци- токинов и факторов роста, и можно ожидать, что транс­плантация клеток вызывает или усугубляет воспаление. Усугубление воспалительного ответа в окружающей инфаркт области было выявлено в модели инсульта у мышей с лечением Г-КСФ [62]. Напротив, введение клеток пуповинной крови человека в крысиной модели вызывало обратное действие, уменьшая воспалительный инфильтрат, о чем судили на основании уменьшения экспрессии провоспалительных цитокинов [79].

Привлечение эндогенных нервных клеток прогениторов

Существование клеток прогениторов в головном мозге и возможность обновления нейронов, глиальных и сосу­дистых клеток дают основание полагать, что после инсульта возможен существенный нейрогенез. Хотя эндогенный нейрогенез при сосудистых заболеваниях головного мозга изучался во многих моделях у грызунов [80-82], у людей было выполнено лишь несколько иссле­дований. В одном из них гистологическое исследование было выполнено у больного 84 лет, перенесшего инсульт за неделю до смерти [83]. При использовании метки нер­вных стволовых клеток, вокруг области инфаркта были выявлены многочисленные нервные стволовые клетки, иммуноположительные в отношении сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) клетки, новые кровеносные сосуды, что свидетельствовало о наличии вызванного ишемией привлечения нервных клеток прогениторов (НКП) и неоваскуляризации. Другое исследование также показало наличие вызванного ише­мией эндогенного нейрогенеза [18].

Факторы роста, такие как МНТФ и фактор роста нер­вов, вовлечены в управление делением и дифференциа­цией мозговых стволовых клеток. Усиление влияния этих естественных нейрогенных факторов путем экзогенного введения может оказаться эффективным лечебным подходом при инсульте. Однако до настояще­го времени была изучена лишь одна молекула: в исследо­вании фазы II/III (286 больных) основного фиброблас- тного фактора роста лечение оказалось неэффективным (выявлена даже тенденция к ухудшению) и вызывало лейкоцитоз и гипотензию [84]. Эффективность лечебных подходов, воздействующих на физиологический меха­низм, управляемый единственным ростовым фактором, может быть ограниченной, как это было отмечено при изучении многих потенциальных нейропротекторов с единственным механизмом действия [85]. Стволовые клетки оказывают действие посредством нескольких механизмов, в частности - привлекая эндогенные клетки прогениторы посредством секреции факторов роста.

Нейрогенез

Остается неясным, могут ли стволовые клетки улучшать восстановление путем репликации и дифференциации ("прямой нейрогенез"), и таким образом - замещения пов­режденных клеток мозга и воссоздания нервных сетей; данные по этому вопросу ограничены и противоречивы. У крыс с индуцированной окклюзией средней мозговой артерии трансплантированные нейросферы оставались живыми через 4 недели после трансплантации, и боль­шинство мигрировавших клеток экспрессировали нейро- нальный фенотип (включая маркеры даблкортин3, р-тубу- лин, глиальный фибриллярный кислый белок) [76]. Нейросферы, выделенные от взрослых крыс с инсультом, также могут дифференцироваться в клетки глии (как и нейроны), и могут мигрировать в направлении ишемичес­кого повреждения [86]. Линия человеческих нервных стволовых клеток (СТХ0Е03, ReNeuron Group pic. [87]), выведенная из человеческих соматических стволовых кле­ток после генетической модификации иммортализирую- щим геном, может дифференцироваться в нейроны и аст- роциты, и в модели инсульта у крыс (окклюзией средней мозговой артерии) приводит к существенному улучше­нию как сенсомоторной функции, так и моторной фун­кции в целом, через 6-12 недель после имплантации [88]. Наконец, у мышей, неспособных к развитию клеток мие- лоидного и лимфоидного рядов, трансплантированные клетки костного мозга (ККМ) мигрировали в головной мозг и экспрессировали специфичные для нейронов анти­гены (NeuN-ядерный белок, который обнаруживается исключительно в нейронах) [34]. В противоположность этому, в другом исследовании, в котором выполнялась трансплантация ККМ мышам, не было обнаружено приз­наков клеток, подобных нервным [89]. Другим группам исследователей также не удалось выявить дифференциа­ции ГСК в клетки нервной ткани [90]. Фактически, в иссле­дованиях с положительными результатами, показавших дифференциацию клеток с формированием нервного фенотипа, выживание лишь небольшого числа клеток свидетельствовало о том, что интеграция в нервные сети хозяина не является единственным или основным меха­низмом действия, улучшающим функциональное восста­новление. Тем не менее, обнаружение того, что ответ может зависеть от числа введенных клеток ("зависимость ответа от дозы") согласуется с благоприятными эффекта­ми, опосредуемыми замещением клеток [91].

Ангиогенез

Нейрогенез сам по себе не приведет к восстановлению, поскольку нейронам нужна обеспечиваемая сосудами пи­тательная поддержка, и потому необходимо образование новых сосудов. Наличие ангиогенеза было обнаружено экспериментально, когда при внутривенном введении костномозговых CD34' клеток мышам через 48 часов пос­ле индукции инсульта отмечалось ускорение образования новых сосудов в сравнении с мышами, которым вводи­лись CD34 клетки [74]. Более того, введение антиангио- генного средства предотвращало благоприятное действие прекурсоров CD34* [74].Хотя ангиогенез может отражать дифференцирование ГСК в клетки стенок кровеносных сосудов, вероятно наличие также непрямого действия, поскольку было показано, что человеческие CD34+ клетки вырабатывают многочисленные ангиогенные факторы, в том числе СЭФР и инсулиноподобный фактор роста (ИФР-1) [92]. Таким образом, богатое сосудистое окруже­ние, опосредуемое CD34+ клетками, может способство­вать последующей нейрональной регенерации.

Пластичность

Нейропластичностью называют организационные изме­нения в головном мозге, в результате которых отдельные нейроны или их сети адаптируют свои функции. Эта тео­рия составляет основу целенаправленной терапевтической реабилитации. Стволовые клетки могут усиливать этот процесс посредством различных механизмов восстановле­ния, включая спраутинг и демаскирование, однако данные в поддержку роли этих механизмов при инсульте остают­ся ограниченными. При экспериментальном инсульте спраутинг был обнаружен после внутривенного введения клеток стромы костного мозга человека крысам: отмечено уменьшение объема повреждения на 50% по сравнению с животными контрольной группы, которым был введен изотонический раствор хлорида натрия [93]. В противопо­ложность этому, в одном из нескольких исследований с отрицательными результатами введение клеток пуповин- ной крови человека не улучшило сенсомоторный или поз­навательный исход у крыс с инсультом [78].

Миграция стволовых клеток

В нескольких экспериментальных исследованиях изуча­лась судьба стволовых клеток, которые не были импланти­рованы непосредственно в место повреждения. В условиях ишемии трансплантированные стромальные клетки кост­ного мозга избирательно мигрировали в ишемизирован- ное полушарие поврежденного головного мозга крыс [94], что свидетельствовало о возможности избирательного привлечения этих клеток поврежденным мозгом. В одном исследовании культивируемые эмбриональные клетки (клеточной линии D3) инкубировались с супер-парамаг- нитными наночастицами окиси железа (что делало их ви­димыми при магниторезонансной визуализации) и затем были трансплантированы в нормальное полушарие крыс, перенесших за 14 дней до этого преходящую ишемию в бассейне средней мозговой артерии. Контраст отслеживали с применением Т2*-взвешенной MPT, которая высоко­чувствительна к "железной метке", и было отмечено, что за 3-7 дней он мигрировал в подвергшееся ишемии полуша­рие и оставался там, по крайней мере в течение 20 дней после имплантации [95]. В другом исследовании Г-КСФ вводили здоровым донорам (людям) для мобилизации СКПК. CD34* клетки извлекали, отделяли иммуномагнит- ным методом и маркировали [96]. Эти клетки затем вводи­ли в здоровое полушарие крысам, которые за 7 дней до этого подверглись окклюзии средней мозговой артерии. Клетки отслеживали методом Т2"-магниторезонансной визуализации. Было обнаружено, что они мигрировали в поврежденное полушарие о оставались там на протяже­нии, по крайней мере, 21-50 дней [96]. Более того, в последующем при иммоногистохимическом исследовании человеческие клетки обнаруживались в области поврежде­ния, в мозолистом теле и субвентрикулярной области. Сохраняется неопределенность в отношении процессов, лежащих в основе миграции стволовых клеток, хотя неко­торые посягательства на ее преодоление все же предприня­ты. Например, оказалось, что стромальноклеточный фак­тор 1а (СФ-1а) и рецептор CXCR4 играют важную роль в миграции трансплантированных внутривенно МСК [97].

Клинические исследования трансплантации стволовых клеток после инсульта

Крупномасштабных исследований трансплантации ство­ловых клеток при инсульте выполнено не было, однако опубликованы результаты нескольких исследований безопасности (табл. 1).

В одном неконтролированном исследовании культиви­рованные нейрональные клетки, полученные из иммор- тализированной клеточной линии (LBS-Neurones), были трансплантированы 12 больным (возраст 44-75 лет) с инсультом (преимущественно с вовлечением базальных ганглиев) [98]. Больные получили по одной или две дозы клеток посредством КТ-направляемой стереотаксичес- кой имплантации. Иммуносуппрессорное прикрытие было осуществлено внутривенным введением метил- преднизолона (в ходе операции), и затем – введением циклоспорина на протяжении 8 недель. Хотя функцио­нальные исходы не могли быть оценены, поскольку ис­следование было слишком малым для такой оценки и не имело контрольной группы, выполненное у 6 больных ПЭТ-сканирование выявило повышение метаболичес­кой активности, что свидетельствовало либо о повыше­нии жизнеспособности клеток, либо о присутствии воспалительных клеток [98]. Интересно, что детальное патогистологическое исследование головного мозга одного из участвовавших в исследовании больных, умер­шего через 27 мес. после имплантации клеток, выявило выживание трансплантированных нейрональных клеток без проявлений злокачественности [99]. Возможность де- дифференциации трансплантированных клеток назад к злокачественному состоянию является одним из теоре­тических опасений при применении трансформирован­ных стволовых клеток, полученных из опухолевых, хотя доклинические исследования введения клеток этой линии (NT2) мышам не выявили токсичности или способности стимулировать опухолевый рос [100].

В рамках продолжения этого исследования авторы провели рандомизированное исследование II фазы, ис­пользуя эту же клеточную линию, у 18 больных [101]. В исследование включали больных в возрасте от 18 до 75 лет с фиксированным двигательным дефицитом, кото­рый оставался неизменным на протяжении не менее 2 мес. В группе больных, подвергавшихся лечению (п=14) выполнялось 1 или 2 введения клеток и реабилитацион­ное лечение; в контрольной группе (п=4) проводилось только реабилитационное лечение. Основная мера исхо­да - оценка по двигательной части Европейской шкалы инсульта (European Stroke Scale motor score) через 6 мес. - не различалась между группами [101].

Недавно было выполнено также исследование безопас­ности и осуществимости применения фетальных свиных клеток у больных через 1,5-10 лет после инфаркта в бас­сейне средней мозговой артерии (с поражением стриату- ма) [102]. Для предотвращения отторжения клетки под­вергали предварительному воздействию анти-МНС-Г антител, и иммуносуппрессорные лекарственные средст­ва больным не вводились. Хотя планировалось включе­ние в исследование 12 больных, были включены только 5, после чего Администрация по пищевым продуктам и лекарственным средствам (FDA) досрочно остановила исследование, поскольку у 2 больных развились серьез­ные неблагоприятные явления. У одного больного насту­пила окклюзия корковой вены вследствие хирургичес­кого вмешательства, а у второго - генерализованные и парциальные эпилептические припадки на фоне гипер­гликемии. Эти наблюдения обращают внимание на воз­можные риски при внутричерепной трансплантации стволовых клеток и указывают на необходимость поиска других моделей введения стволовых клеток.

Один из таких альтернативных путей заключается в применении аутологичных стволовых клеток. Недавно в рандомизированном контролированном исследовании оценивалось применение МСК у больных с инфарктом в бассейне средней мозговой артерии [103]. Пять больных со стойким неврологическим дефицитом, сохранявшимся через 7 дней после ишемического инсульта, были включе­ны в группу внутривенного введения МСК, и 25 больных - в контрольную группу (в которой не выполнялись ника­кие дополнительные вмешательства, в том числе - ложное вмешательство трансплантации). МСК были получены из аспиратов костного мозга и затем культивировались ех vivo для добычи достаточных количеств клеток, которые затем вводились больному через 4-6 нед. и через 7-9 нед. после возникновения симптомов инсульта. Через 1 год 10 больных из контрольной группы выбыли из поля зрения исследователей, однако серьезных неблагоприятных явле­ний - таких как инфекционные осложнения или форми­рование опухолей - отмечено не было. Это исследование показало выполнимость лечебного подхода, заключающе­гося во введении культивированных ex vivo МСК, однако авторы подверглись жесткой критике как за использован­ные ими методы, так и за сформулированные ими выводы [104] и принесли извинения за допущенный ими плагиат в написании обсуждения своих результатов [105].

 

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в клинике инсульта

Три небольших рандомизированных контролированных исследования оценили безопасность рекомбинантного гра- нулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) после ишемического инсульта (табл. 2). Недавно завершен­ное исследование II фазы с приращением дозы оценивало применение Г-КСФ у 36 больных (Г-КСФ - п=24, плацебо - п=12) с ишемическим инсультом в подостром периоде [ 106]. Лечение проводили в промежуток времени от 7 по 30 дни после инсульта подкожным введением Г-КСФ в нарас­тающих дозах (1-10 мкг/кг либо однократно, либо ежеднев­но на протяжении 5 дней). Введение Г-КСФ сопровожда­лось зависимым от дозы повышением числа CD34+ клеток (измерение поточной цитометрией) до 10-кратного уровня, с достижением пикового уровня на 5-й день. Были отмече­ны также зависимое от дозы повышение числа лейкоцитов на 3-й день и снижение числа тромбоцитов, чего и следова­ло ожидать при применении Г-КСФ. Частота серьезных неблагоприятных явлений не различалась между группами, хотя частота инфекционных осложнений была недостовер­но выше в группе больных, получавших Г-КСФ (29% в срав­нении с 25%); частота рецидивирования инсульта не разли­чалась между сравниваемыми группами.

Во втором исследовании 10 больных с оценками по шка­ле тяжести инсульта Национальных институтов здоровья (NIHSS) в пределах от 9 до 20 и не позже 7 дней после инсульта были рандомизированы в группы 5-дневного лечения Г-КСФ (15 мкг/кг в сутки, п=7) и контрольную (рутинные лечение и уход, п=3) [107]. При последующем наблюдении на протяжении 12 мес. у больных, получавших Г-КСФ, было достигнуто существенно более выраженное улучшение неврологических функций и уменьшение фун­кциональной несостоятельности, чем у больных контроль­ной группы. Не было отмечено усугубления симптомов ин­сульта и тромботических осложнений. К сожалению, следу­ет отметить предвзятость результатов, поскольку у многих больных, которым проводилось лечение Г-КСФ, имел место лакунарный инфаркт, т.е. вариант инсульта, при котором улучшение часто наступает спонтанно.

В третьем исследовании больные в течение недели после возникновения инсульта были рандомизированы в группы лечения Г-КСФ (15 больных) или плацебо (30 больных) [ 108 ]. Было отмечено недостоверное снижение оценки NIHSS на 10-й день, которое стало достоверным на 20-й день.

В кокрейновском систематическом обзоре трех исследо­ваний применения Г-КСФ (а также других КСФ) при ин­сульте не было выявлено достоверного влияния Г-КСФ на функциональный исход, хотя отмечена тенденция к сниже­нию тяжести повреждения [ 109]. Долговременный монито­ринг безопасности применения Г-КСФ был выполнен у 101 здорового донора, которым Г-КСФ вводили с целью моби­лизации СКПК перед аллогенной трансплантацией. Явных неблагоприятных явлений не было отмечено при наблюде­нии на протяжении 3-6 лет; в частности не было отмечено повышения частоты рака и сосудистых заболеваний [110]. Тем не менее, Г-КСФ может вызывать состояние повышен­ной свертываемости крови [ 111 ], которое может быть меха­низмом повышения частоты рецидивирования инсульта. У здоровых доноров, получающих Г-КСФ, тест кровотечения in vitro сокращен, уровни фактора VIII и фибриногена повышены, активность протеинов С и S - снижена [111].

Продолжаются исследования применения Г-КСФ, в частности - проводится исследование приращения дозы(30-180 мкг/кг) при остром ишемическом инсульте (п=44), исследование в подостром периоде инсульте (п=60), исследование в хроническом периоде инсульта - через 3 мес. после возникновения (п=40); в настоящее время идет также неконтролированное исследование [109]. Данные этих завершенных и продолжающихся исследований покажут, нужны ли изучение Г-КСФ в более крупных исследованиях III фазы. Хотя другие КСФ, такие как СКФ, гранулоцитарно-макрофагальный коло- ниестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), М-КСФ или КСФ-1, также мобилизуют КМСК, и доступны их реком- бинантные формы, опубликованных исследований их применения при инсульте пока что нет [109].

Таблица 2. Резюме клинических исследований Г-КСФ при ишемическом инсульте

Автор

 

 

Время

Число больных

 

(год)

Дизайн

Схема введения

после

(активное лечение/

 

[источник] исследования

Г-КСФ

инсульта

контроль)

Комментарии

Shyu

Простое слепое

15 мкг/кг/сутки п/к на

Не позже 7 дней

7/3

Отсутствие тромботических ос­

(2006)

контролированное

протяжении 5 дней

 

 

ложнений. Улучшение исхода в

[107]

 

 

 

 

группе лечения Г-КСФ, однако в

 

 

 

 

этой группе преобладали боль­

 

 

 

 

 

ные с лакунарным инсультом.

Sprigg

Двойное слепое

Приращение дозы

Через 7-30 дней

24/12

Отсутствие различия частоты СНЯ,

(2006)

плацебо-

1-10 мкг/кг/сутки п/к на

после возникновения

 

однако недостоверное повышение

[106]

контролированное

протяжении 1 или

инсульта

 

частоты инфекционных осложне­

 

 

5 дней

 

 

ний в фуппе лечения Г-КСФ.

Zhang

Двойное слепое

2 мкг/кг/сутки п/к

Не позже 7 дней

15/45

Отсутствие различия частоты

(2006)

плацебо-

на протяжении 5 дней

 

 

СНЯ. Достоверное снижение

[108]

контролированное

 

 

 

оценки по шкале NIHSS

Г-КСФ

гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; СНЯ - серьезное неблагоприятное явление; п/к - подкожно.

NIHSS -

оценка по шкале тяжести инсульта Национальных институтов здоровья.

 

 

 

 

Будущие разработки в области примене­ния стволовых клеток для лечения инсульта

Хотя опубликованы результаты многих доклинических исследований, оценивавших применение стволовых кле­ток при моделировании инсульта, и к настоящему време­ни уже доступны некоторые результаты клинических исследований, многие вопросы остаются без ответа. Обращает на себя внимание также то, что отрицательные или нейтральные результаты представлены лишь в очень небольшом числе опубликованных исследований. Эта предвзятость публикаций может способствовать продол­жению разработки неуместных клинических исследова­ний, которые не устранят сохраняющиеся в данной отрасли неясности [112]. Чрезвычайно важно, чтобы бу­дущие экспериментальные исследования имели высокое качество (например, соответствовали критериям STAIR) [113] и стандартизированные протоколы и меры исхода, чтобы их результаты можно было легко сравнивать.

Одно возможное преимущество применения стволо­вых клеток в лечении инсульта заключается в потенци­ально широком терапевтическом окне. Оптимальное время введения после возникновения инсульта может зависеть от микроокружения области повреждения, и по­ка неясно, необходимо ли вводить стволовые клетки на протяжении острой фазы инсульта, когда выраженность воспалительного ответа максимальна, или будет более эф­фективным отсроченное лечение, когда уже сформирова­лась рубцовая ткань? Воспалительный ответ может сохра­няться на протяжении нескольких недель; возможно, что стволовые клетки способны усугублять или ослаблять этот процесс. Относительно немногие исследования анализировали эффекты стволовых клеток при внутри- мозговом кровоизлиянии (ВМК), но было отмечено уменьшение выраженности воспалительного ответа в одном исследовании, оценивавшем внутривенное вве­дение человеческих нервных стволовых клеток при экспериментальном ВМК [114]; большинство трансплан­тированных клеток было обнаружено в граничных зонах селезенки, и лишь немногие клетки были выявлены в сре­зах головного мозга. Трансплантация стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ) [115] при экспериментальном ВМК также приводила к уменьшению воспалительного ответа, однако при этом не было выявлено каких-либо свидетельств нейрональной трансдифференциации.

Неясно, какой путь введения стволовых клеток опти­мален. Этот вопрос изучался в одном доклиническим исследовании, сравнивавшем введение нервных клеток прекурсоров в стриатум, в желудочки головного мозга, и внутривенно, во всех случаях клетки направлялись к зоне повреждения [ 116]. В противоположность этому, в другом исследовании, оценивавшем внутривенное введение кле­ток человеческой пуповинной крови крысам с инсультом, не было выявлено признаков стволовых клеток в зоне повреждения [117]. Если внутримозговое введение являет­ся наиболее эффективным (хотя, вероятно, и наиболее опасным), то следует ли вводить клетки непосредственно в зону ишемического повреждения, или в отдаленные от нее области (для снижения риска повреждения жизненно важных структур), полагаясь на спонтанную миграцию стволовых клеток [76,95,118]? В выполненных исследова­ниях безопасности у человека внутримозговые инъекции стволовых клеток выполнялись непосредственно в периинфарктную зону [98, 101], но это решение не осно­вывалось на результатах сколько-нибудь существенных доклинических исследований. Остается неясной роль им- муносуппрессии при такой экзогенной трансплантации.

Существуют многочисленные источники экзогенных стволовых клеток (коммерческой разработке подвергают­ся, по крайней мере, 5 типов стволовых клеток взрослых [119]), и остается неустановленным, клетки какого типа следует трансплантировать при инсульте конкретного типа и размера. Привлекательной альтернативой может быть лечение эндогенными стволовыми клетками, при котором нет необходимости в иммуносуппрессии. У больных с ише- мическим инсультом стволовые клетки CD34* могут быть мобилизованы в периферическую кровь введением Г-КСФ, при котором эффект зависит от дозы [106], однако воз­можно, что при этом непосредственное нейрозащитное действие Г-КСФ играет более важную роль, чем мобилизо­ванные им стволовые клетки. Г-КСФ характеризуется хо­рошей безопасностью и фармакологическим профилем для применения в клинике, и, хотя и принципиально важ­но, чтобы клиническим исследованиям предшествовала тщательная доклиническая разработка (доклинические данные об оптимальных дозировках и времени введения Г- КСФ все еще отсутствуют), уже были начаты клинические исследования II и III фаз применения Г-КСФ и других КСФ, таких как эритропоэтин, в лечении инсульта.

Заключение

С разработкой лечебного применения стволовых клеток связаны, с одной стороны, большие надежды, с другой стороны - мошенничество. Однако все еще предстоит найти ответы на многие вопросы, и в настоящее время  больным не следует выполнять лечение стволовыми клетками вне соответствующим образом разработанных рандомизированных контролированных исследований.

Выражение признательности

Т.Е. получает финансирование от MRC, P.M. и Р.В. являются получателями гранта на исследование гемопоэ- тических стволовых клеток от ESRC; Р.В. является профессором медицины инсульта Ассоциации инсульта (Stroke Association Professor of Stroke Medicine). T.E и Р.В. участвуют в проведении финансированного MRC исследования II фазы, оценивающего мобилизирующее действие Г-КСФ на ГСК при ишемическом инсульте.

Сокращения

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (англ. G-CSF - granulocyte colony stimu­lating factor);

ГСК - гемопоэтическая стволовая клетка (англ. HSC -

hematopoietic stem cell); ИФР - инсулиноподобный фактор роста (англ. IGF -

insulin-like growth factor); ККМ - клетка костного мозга (англ. ВМС - bone mar­row cells);

КМСК - костномозговая стволовая клетка (англ. BMSC -

bone marrow derived stem cell); КСФ - колониестимулирующий фактор (англ. CSF -

colony stimulating factor); МНТФ - мозговой нейротрофический фактор (англ.

BDNF - brain derived neurotrophic factor); MCK - мезенхимальная стволовая клетка (англ. MSC -

mesenchymal stem cells); НКП - нервная клетка прогенитор (англ. NPC - neural

progenitor cell); СКЖТ - стволовые клетки жировой ткани (англ. ASC -

adipose-derived stem cells); СКПК - стволовая клетка периферической крови

(англ. PBSC - peripheral blood stem cell); СКФ - стволовоклеточный фактор (англ. SCF - stem cell factor);

СФ-la - стромально-клеточный фактор 1а (англ. SDF-

la - stromal cell-derived factor 1а); СЭФР - сосудистый эндотелиальный фактор роста (англ. VEGF - vascular endothelial growth factor) 

Литература

1.       Rothwell PM, Coull AJ, Silver LE et al. Population-based study of event-rate, incidence, case fatality, and mortality for all acute vascular events in all arterial territories (Oxford Vascular Study). Lancet 2005; 366: 1773-83.

2.       Bath PM, Lees KR. ABC of arterial and venous disease. Acute stroke. BMJ 2000; 320:920-3.

3.       Bath PM, Lindenstrom E, Boysen G et al. Tinzaparin in acute ischae- mic stroke (TAIST): a randomised aspirin-controlled trial. Lancet 2001; 358:702-10.

4.       Ferro JM, Davalos A. Other neuroprotective therapies on trial in acu­te stroke. Cerebrovasc Dis 2006; 2:127-30.

5.       The ATLANTIS ECASS and NINDS rt-PA Study Group Investigators. Association of outcome with early stroke treatment: pooled analysis of ATLANTIS, ECASS, and NINDS rt-PA stroke trials. Lancet 2004; 363:768-813.

 

6.       Vahedi K, Hofmeijer J, Juettler E et al. Early decompressive surgery in malignant infarction of the middle cerebral artery: a pooled analysis of three randomised controlled trials [see comment]. Lancet Neurol 2007; 6:215-22.

 

7.       StrokeUnit Trialists' Collaboration. Organised inpatient (stroke unit) care for stroke. Cochrane Database Syst Rev 2007: CD000197.

 

8.       Cowan CA, Melton DA. "Sternness": definitions, criteria and stan­dards; in Lanza R (ed): Handbook of Stem Cells, 1st edn. Burlington, San Diego, USA: Elsevier Academic Press, 2004: xxv-xxxi.

 

9.       Safety and efficacy study of autologous stem cell transplantation for early onset type I diabetes mellitus. Available at http: //clinicaltri- als.gov/ct/show/NCT00315133 (accessed 28 January 2008).

10.    Donor stem cell transplant in treating patients with hematologic can­cer. Available at http: //clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00054327 (ac­cessed 28 January 2008).

11.    Freed CR, Greene PE, Breeze RE et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. New Engl J Med 2001;344:710-9.

 

12.    Stamm C, Kleine HD, Choi YH et al. Intramyocardial delivery of CD 1331 bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease: safety and efficacy studies. J Thorac Cardiovasc Surg 2007; 133:717-25.

 

13.    Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson Tet al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med 1998; 4:1313-7.

14.    Roy NS, Wang S, Jiang L et al. In vitro neurogenesis by progenitor cells isolated from the adult human hippocampus. Nat Med 2000; 6:271 -7.

15.    Richardson RM, Holloway KL, Bullock MR, BroaddusWC, Fillmore HL. Isolation of neuronal progenitor cells from the adult human ne­ocortex. Acta Neurochir 2006; 148:773-7.

16.    Zhao M,MommaS, DelfaniKet al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. ProcNatl Acad Sci USA 2003; 100:7925-30.

17.    Pagano SF, Impagnatiello F, GirelliMet al. Isolation and characteriza­tion of neural stem cells from the adult human olfactory bulb. Stem Cells 2000; 18:295-300.

18.    Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O. Neuronal repla­cement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 2002; 8:963-70.

19.    Kukekov VG, Laywell ED, Suslov О et al. Multipotent stem/progenitor cells with similar properties arise from two neurogenic regions of adult human brain. Exp Neurol 1999; 156:333-44.

20.    Chu K, Kim M, Park KI et al. Human neural stem cells improve sen­sorimotor deficits in the adult rat brain with experimental focal isc­hemia. Brain Res 2004; 1016:145-53.

21.    Darsalia V, Kallur T, Kokaia Z. Survival, migration and neuronal dif­ferentiation of human fetal striatal and cortical neural stem cells graf­ted in stroke-damaged rat striatum. Eur J Neurosci 2007; 26:605-14.

22.    Seaberg RM, Smukler SR, van der Kooy D. Intrinsic differences distin­guish transiently neurogenic progenitors from neural stem cells in the early postnatal brain. Dev Biol 2005; 278:71-85.

23.    Buhnemann C, Scholz A, Bernreuther С et al. Neuronal differentiati­on of transplanted embryonic stem cell-derived precursors in stroke lesions of adult rats. Brain 2006; 129:3238-48.

24.    Wei L, Cui L, Snider BJ et al. Transplantation of embryonic stem cells overexpressing Bcl-2 promotes functional recovery after transient ce­rebral ischemia. Neurobiol Dis 2005; 19:183-93.

25.    Pollard S, Conti L, Smith A. Exploitation of adherent neural stem cells in basic and applied neurobiology. Regen Med 2006; 1:111-8.

26.    Erdo F, Buhrle C, Blunk J et al. Host-dependent tumorigenesis of embryonic stem cell transplantation in experimental stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2003; 23:780-5.

27.    Schumacher JM, Ellias SA, Palmer EP et al. Transplantation of emb­ryonic porcine mesencephalic tissue in patients with PD. Neurology 2000; 54:1042-50.

28.    Dunnett SB, Rosser AE. Stem cell transplantation for Huntington's disease. Exp Neurol 2007; 203:279-92.

29.    Dinsmore JH, Manhart C, Raineri R, Jacoby DB, Moore A. No eviden­ce for infection of human cells with porcine endogenous retrovirus (PERV) after exposure to porcine fetal neuronal cells. Transplantati­on 2000; 70:1382-9.

30.    Andrews PW, Damjanov I, Simon D et al. Pluripotent embryonal car­cinoma clones derived from the human teratocarcinoma cell line Te- ra-2. Differentiation in vivo and in vitro. Lab Invest 1984; 50:147-62.

31.    Trojanowski JQ, Kleppner SR, Hartley RS et al. Transfectable and transplantable postmitotic human neurons: a potential "platform" for gene therapy of nervous system diseases. Exp Neurol 1997; 144:92-7.

32.    Bianco P, Robey G. Skeletal stem cells; in Lanza R (ed): Handbook of Stem Cells, 1st edn. Burlington, San Diego, USA: Elsevier Academic Press, 2004:415-4125.

33.    Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol 2000; 164:247-56.

34.    Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, McKercher SR. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 2000; 290:1779-82.

35.    Li Y, Chen ), Chopp M. Adult bone marrow transplantation after stro­ke in adult rats. Cell Transplant 2001; 10:31-40.

36.    Zhao LR, Duan WM, Reyes M, Keene CD, Verfaillie CM, Low WC. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ame­liorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats. Exp Neurol 2002; 174:11-20.

37.    Terada N, Hamazaki T, Oka M et al. Bone marrow cells adopt the phe- notype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416:542-5.

38.    Rossi DJ, Bryder D, Seita J, Nussenzweig A, Hoeijmakers J,Weissman IL. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haema­topoietic stem cells with age. Nature 2007; 447:725-9.

39.    Chen J, Sanberg PR, Li Yet al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32:2682-8.

40.    Nagai A, Kim WK, Lee HJ et al. Multilineage potential of stable hu­man mesenchymal stem cell line derived from fetal marrow. PLoS ONE [Electronic ResourceI 2007; 2:el272.

41.    Sokolova I, Fedotova O, Zin'Kova N, Kruglyakov P, PolyntsevD. Effect of mesenchymal stem cell transplantation on cognitive function in rats with ischaemic stroke. Bull Exp Biol Med 2006; 2:511-4.

42.    Borlongan CV, Evans A, Yu G, Hess DC. Limitations of intravenous human bone marrow CD 1331 cell grafts in stroke rats. Brain Res 2005; 1048:116-22.

43.    Guo Y, Lubbert M, Engelhardt M. CD34_ hematopoietic stem cells: current concepts and controversies. Stem Cells 2003; 21:15-20.

44.    Shintani S, Murohara T, Ikeda H et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circula­tion 2001; 103:2776-9.

45.    Dunac A, Frelin C, Popolo-Blondeau M, Chatel M, Mahagne M, Phi­lip P. Neurological and functional recovery in human stroke are asso­ciated with peripheral blood CD341 cell mobilization. ] Neurol 2007; 254:327-32.

46.    Hennemann B, Ickenstein G, Sauerbruch S et al. Mobilization of CD341 hematopoietic cells, colony-forming cells and long-term cul- ture-initiating cells into the peripheral blood of patients with an acu­te cerebral ischemic insult. Cytotherapy 2008; 10:303-11.

47.    Taguchi A, Matsuyama T, Moriwaki H et al. Circulating CD34-positi- ve cells provide an index of cerebrovascular function. Circulation 2004; 109:2972-5.

48.    Schmidt-Lucke C, Rossig L, Fichtlscherer S et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation 2005; 111:2981-7.

49.    Jung KH, Chu K, Lee STet al. Identification of neuronal outgrowth cells from peripheral blood of stroke patients. Ann Neurol 2008; 63:312-22.

50.    Jin K.MaoXO, SunY, Xie L, GreenbergDA. Stem cell factor stimulates neurogenesis in vitro and in vivo. / Clin Invest 2002; 110:311 -9.

51.    Brines ML, Ghezzi P, Keenan S et al. Erythropoietin crosses the blo­od-brain barrier to protect against experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:10526-31.

52.    Gibson CL, Bath PM,Murphy SP. G-CSF reduces infarct volume and improves functional outcome after transient focal cerebral ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab 2005; 25:431-9.

53.    Schabitz WR, Kruger C, Pitzer С et al. A neuroprotective function for the hematopoietic protein granulocyte-macrophage colony stimula­ting factor (GM-CSF). J Cereb Blood Flow Metab 2008; 28:29-43.

54.    Vincent VA, Robinson CC, Simsek D, Murphy GM. Macrophage co­lony stimulating factor preventsNMDA-induced neuronal death in hippocampal organotypic cultures. ] Neurochem 2002; 82:1388-97.

55.    Schabitz WR, Kollmar R, Schweninger M et al. Neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor after focal cerebral ischemia. Stroke 2003; 34:745-51.

56.    Kollmar R, Henninger N, Urbanek C, Schabitz W, Schneider A, Schwab S. Effects of G-CSF in combination with rt-PA after experi­mental thromboembolic stroke. Akt Neurol 2004; 31:S1,V88.

57.    Kollmar R, Henninger N, Urbanek C, Schwab S. G-CSF and rt-PA for the treatment of experimental embolic stroke. Cerebrovasc Dis 2007; 23(Suppl. 2):23.

58.    ShyuWC, Lin SZ, Yang HI et al. Functional recovery of stroke rats in­duced by granulocyte colony-stimulating factor-stimulated stem cells. Circulation 2004; 110:1847-54.

59.    Lee ST, Chu K, Jung KH et al. Granulocyte colony-stimulating factor enhances angiogenesis after focal cerebral ischemia. Brain Res 2005; 1058:120-8.

60.    Sehara Y, Hayashi T, Deguchi К et al. Potentiation of neurogenesis and angiogenesis by G-CSF after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res 2007; 1151:142-9.

61.    Schneider A, Kruger C, Steigleder T et al. The hematopoietic factor G- CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis. / Clin Invest 2005; 115:2083-98.

62.    Taguchi A,Wen Z, Myojin К et al. Granulocyte colony-stimulating factor has a negative effect on stroke outcome in a murine modelwa. Eur J Neurosci 2007; 26:126-33.

63.    Zhao LR, Berra HH, Duan WM et al. Beneficial effects of hematopo­ietic growth factor therapy in chronic ischemic stroke in rats. Stroke 2007; 38:2804-11.

64.    Matchett GA, Calinisan JB, Matchett GC, Martin RD, Zhang JH. The effect of granulocyte-colony stimulating factor in global cerebral isc­hemia in rats. Brain Res 2007; 1136:200-7.

65.    Komine-KobayashiM, Zhang N, LiuMet al. Neuroprotective effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in transi­ent focal ischemia of mice. J Cereb Blood Flow Metab 2006; 26:402-13.

66.    GibsonCL, JonesNC,PriorMJ,BathPM,MurphySP.G-CSF suppresses edema formation and reduces interleuldn-lbeta expression after ce­rebral ischemia in mice. J Neuropathol Exp Neurol 2005; 64:763-9.

67.    Jacobs KM, Donoghue JP. Reshaping the cortical motor map by un­masking latent intracortical connections. Science 1991; 251:944-7.

68.    Carmichael ST, Chesselet MF. Synchronous neuronal activity is a sig­nal for axonal sprouting after cortical lesions in the adult. JNeurosci 2002; 22:6062-70.

69.    Bliss TV, Collingridge GL. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 1993; 361:31-9.

70.    Pantano P, Baron JC, Samson Y, Bousser MG, Derouesne C, Comar D. Crossed cerebellar diaschisis. Further studies. Brain 1986; 109:677-94.

71.    Jin K, Minami M, Lan JQ et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:4710-5.

72.    Vaynman S, Gomez-Pinilla F. License to run: exercise impacts functi­onal plasticity in the intact and injured central nervous system by using neurotrophins. Neurorehabil Neural Repair 2005; 19:283-95.

73.    Sprigg N, Bath P. Pharmacological enhancement of recovery from stroke. Curr Med Literature Stroke Rev 2005; 8:33-9.

74.    Taguchi A, Soma T, Tanaka H et al. Administration of CD341 cells af­ter stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. I Clin Invest 2004; 114:330-8.

75.    Ishibashi S, Sakaguchi M, Kuroiwa T et al. Human neural stem/pro- genitor cells, expanded in long-term neurosphere culture, promote functional recovery after focal ischemia in Mongolian gerbils. J Neu- rosci Res 2004; 78:215-23.

76.    Kelly S, Bliss TM, Shah AK et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:11839-44.

77.    Nystedt I, Makinen S, Laine J, Jolkkonen J. Human cord blood CD341 cells and behavioral recovery following focal cerebral ischemia in rats. Acta Neurobiol Exp 2006; 66:293-300.

78.    Makinen S, Kekarainen T, Nystedt J et al. Human umbilical cord blo­od cells do not improve sensorimotor or cognitive outcome following transient middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res 2006; 1123:207-15.

79.    Vendrame M, Gemma C, de Mesquita D et al. Anti-inflammatory ef­fects of human cord blood cells in a rat model of stroke. Stem Cells Dev 2005; 14:595-604.

80.    Lee SH, Kim YJ, Lee KM, Ryu S, Yoon BW. Ischemic preconditioning enhances neurogenesis in the subventricular zone. Neuroscience 2007; 146:1020-31.

81.    Ray J, Gage FH. Differential properties of adult rat and mouse brainde- rived neural stem/progenitor cells. Mol Cell Neurosci 2006; 31:560-73.

82.    YagitaY,KitagawaK,OhtsukiTet al.Neurogenesis byprogenitor cells in the ischemic adult rat hippocampus. Stroke 2001; 32:1890-6.

83.    Minger S, Ekonomou A, Carta E, Chinoy A, Perry R, Ballard C. Endo­genous neurogenesis in the human brain following cerebral infarcti­on. Regen Med 2007; 2:69-74.

84.    Bogousslavsky J.Victor S, Salinas E et al. Fiblast (Trafermin) in acute stroke: results of the European-Australian phase II/III safety and effi­cacy trial. Cerebrovasc Dis 2002; 14:239-51.

85.    Lees KR, Muir KW. Excitatory amino acid antagonists for acute stro­ke. Cochrane Database Syst Rev 2003; CD001244.

86.    Zhang R, Zhang Z, Wang L et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the in­farct boundary in adult rats. / Cereb Blood Flow Metab 2004; 24:441-8.

87.    Sinden JD. ReNeuron group pic. Regen Med 2006; 1:143-7.

88.    Pollock K, Stroemer P, Patel S et al.Aconditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol 2006; 199:143-55.

89.    Castro RF, Jackson KA, Goodell MA, Robertson CS, Liu H, ShineHD. Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. Science 2002; 297:1299.

90.    Wagers AJ, Sherwood RI, Christensen JL,Weissman IL. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Scien­ce 2002; 297:2256-9.

91.    Vendrame M, Cassady J, Newcomb J et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues be­havioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35:2390-5.

92.    Majka M, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J et al. Numerous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34( 1) cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner. Blood 2001; 97:3075-85.

93.    Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell li­ne population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neuro­logical deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14:722-33.

94.    Chen J, Li Y, Wang L et al. Therapeutic benefit of intravenous admi­nistration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke 2001; 32:1005-11.

95.    Hoehn M, Kustermann E, Blunk J et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:16267-72.

96.    Jendelova P, Herynek V, Urdzikova L et al. Magnetic resonance trac­king of human CD34 progenitor cells separated by means of immu- nomagnetic selection and transplanted into injured rat brain. Cell Transplant 2005; 14:173-82.

97.    Wang Y, Deng Y, Zhou GQ. SDF-lalpha/CXCR4-mediated migration of systemically transplanted bone marrow stromal cells towards isc­hemic brain lesion in a rat model. Brain Res 2008; 1195:104-12.

98.    Kondziolka D, Wechsler L, Goldstein S et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology 2000; 55:565-9.

99.    Nelson PT, Kondziolka D, Wechsler L et al. Clonal human (hNT) ne­uron grafts for stroke therapy: neuropathology in a patient 27 months after implantation. Am J Pathol 2002; 160:1201-6.

100.        Kleppner             SR, Robinson KA, Trojanowski JQ, Lee VM. Transplanted human neurons derived from a teratocarcinoma cell line (NTera-2) mature, integrate, and survive for over 1 year in the nude mouse bra­in./ Comp Neurol 1995; 357:618-32.

101.                  KondziolkaD,              Steinberg GK,Wechsler L et al. Neurotransplantation for patients with subcortical motor stroke: a phase 2 randomized tri­al. J Neurosurg 2005; 103:38-45.

102. 102.Savitz SI, Dinsmore J, Wu J, Henderson GV, Stieg P, Caplan LR. Neu­rotransplantation of fetal porcine cells in patients with basal ganglia infarcts: a preliminary safety and feasibility study. Cerebrovasc Dis 2005; 20:101-7.

103. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol 2005; 57:874-82.

104. De Keyser J. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stro­ke patients [comment]. Ann Neurol 2005; 58:653-4; author reply 654-5.

105. Bang OY. An apology: inadvertent error in our article published in Ju­ne 2005 issue of the Ann Neurol (Ann Neurol 2005; 57:874-882). Ann Neurol 2005; 58:659.

106. Sprigg N, Bath PM, Zhao L et al. Granulocyte-colony-stimulating fac­tor mobilizes bone marrow stem cells in patients with subacute ische­mic stroke: the Stem cell Trial of recovery EnhanceMent after Stroke (STEMS) pilot randomized, controlled trial (ISRCTN 16784092). Stroke 2006; 37:2979-83.

107. 107.Shyu WC, Lin SZ, Lee CC, Liu DD, Li H. Granulocyte colonystimula- ting factor for acute ischemic stroke: a randomized controlled trial. CMAJ 2006; 174:927-33.

108. Zhang JJ, Deng M, Zhang Y, Sui W, Wang L, Sun A. A short-term as­sessment of Recombinant Granulocyte-Stimulating factor (RHGCSF) in treatment of acute cerebral infarction. Cerebrovasc Dis 2006; 21(Suppl. 4):143.

109. Bath PM, Sprigg N. Colony stimulating factors (including erythropo­ietin, granulocyte colony stimulating factor and analogues) for stro­ke. Cochrane Database Syst Rev 2006; 3:CD005207.

110. Cavallaro AM, Lilleby K, Majolino I et al. Three to six year follow-up of normal donors who received recombinant human granulocyte co­lony-stimulating factor. Bone Marrow Transplant 2000; 25:85-9.

111. lll.Sohngen D,Wienen S, SieblerMet al. Analysis of rhG-CSF-effects on platelets by in vitro bleeding test and transcranial Doppler ultrasound examination. Bone Marrow Transplant 1998; 22:1087-90.

112. Ioannidis JP. Contradicted and initially stronger effects in highly cited clinical research .JAMA 2005; 294:218-28.

113. Anonymous. Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development. Stroke 1999; 30:2752-8.

114. Lee ST, Chu K, Jung KH et al. Anti-inflammatory mechanism of int­ravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke. Brain 2008; 131:616-29.

115. Kim JM, Lee ST, Chu К et al. Systemic transplantation of human adi­pose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model. Brain Res 2007; 1183:43-50.

116. Jin K, Sun Y, Xie L et al. Comparison of ischemia-directed migration of neural precursor cells after intrastriatal, intraventricular, or intra­venous transplantation in the rat. Neurobiol Dis 2005; 18:366-74.

117.                                      BorlonganCV,Hadman   M, SanbergCD, Sanberg PR. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke. Stroke 2004; 35:2385-9.

118.  Modo      M.Mellodew K, CashDet al.Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage 2004; 21:311-7.

119.   Martin    PA, Coveney C, Kraft A, Brown N, Bath P. Commercial deve­lopment of stem cell technology: Lessons fromthe past, strategies for the future. Regen Med 2006; 1:801-7.